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TERAPIA GÊNICA COM CÉLULAS-TRONCO HUMANAS: segura e eficaz

TERAPIA GÊNICA COM CÉLULAS-TRONCO HUMANAS: segura e eficaz

Vol. 1, N. 9, 01 de Abril de 2014
DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2014.04.01.001

Dois estudos recentes na revista científica Science relatando o resultado da correção gênica utilizando lentivírus em células-tronco hematopoéticas (HSCs, hematopoietic stem cells) para tratar pacientes humanos têm, potencialmente, registrado o marco do início de uma nova era da terapia genética segura e eficaz.

Primeiramente, temos que decifrar o que é a terapia gênica ou genética e o por quê de somente agora ter-se conseguido essa façanha, já que, certamente, já ouvimos sobre essa terapia há muitos anos, desde meados da década de 80 do século passado.

Terapia genética ou Geneterapia é a inserção de genes nas células e tecidos de um indivíduo para o tratamento de uma doença; em especial, doenças hereditárias, aquelas em que o DNA foi mutado gerando genes que resultam em uma pior qualidade de vida. A terapia genética visa a suplementar com alelos, ou genes, funcionais aqueles que são defeituosos.

Na década de 80, avanços na biologia molecular já permitiam que os genes humanos fossem sequenciados e clonados. Cientistas que procuravam por um método para facilitar a produção de proteínas — tais como insulina — pesquisaram a introdução de genes humanos no DNA de bactérias. As bactérias, geneticamente modificadas, passaram, então, a produzir a proteína correspondente, que podia ser recolhida e injetada em pessoas que não a podiam produzir naturalmente.

Em 14 de setembro de 1990 pesquisadores do National Institutes of Health, nos Estados Unidos, realizaram a primeira terapia genética autorizada em Ashanti DeSilva, de 4 anos de idade. Nascida com uma rara doença genética chamada Imunodeficiência Combinada Grave, ela não tinha um sistema imunológico saudável, e era vulnerável a todos os germes com que tivesse contato. Como resultado, o corpo da criança é incapaz de combater infecções. Este processo da doença também é conhecido como a síndrome do “menino da bolha”, porque viver no ambiente normal pode ser fatal para essas crianças. Crianças com essa doença geralmente desenvolvem muitas infecções e raramente sobrevivem à idade adulta.

Na terapia genética realizada em Ashanti, os médicos recolheram glóbulos brancos do corpo da criança, e cultivaram as células em laboratório. No segundo momento, inseriram o gene que faltava nas células e reintroduziram os glóbulos brancos geneticamente modificados na corrente sanguínea da paciente. Exames de laboratório mostraram que a terapia fortaleceu o sistema imunológico de Ashanti; ela parou de contrair resfriados recorrentes e pôde voltar a frequentar a escola. Esse procedimento não a curou; os leucócitos geneticamente modificados só funcionaram por poucos meses, e o processo teve de ser frequentemente repetido (VII, Thompson, 1993).

Embora essa explicação simplificada de terapia genética possa soar como um final feliz é apenas um capítulo inicial otimista numa longa história. O percurso até a primeira terapia genética autorizada foi conturbado e cheio de controvérsia. A biologia da terapia genética em humanos é muito complexa, e há ainda muitas técnicas que precisam ser desenvolvidas e doenças que precisam ser entendidas de maneira mais completa antes que a terapia genética possa ser usada apropriadamente.

Cientistas tomaram a iniciativa de tentar introduzir genes diretamente nas células humanas, focando doenças causadas por defeitos em genes simples, tais como fibrose cística, hemofilia e distrofia muscular. Entretanto, esse objetivo foi muito mais difícil de alcançar que modificar bactérias simples, principalmente por causa dos problemas envolvidos no transporte de grandes seções de DNA e no seu posicionamento no lugar certo do genoma.

Processo básico

A maioria dos estudos a respeito de terapia genética, um gene “normal” é inserido no genoma para substituir um gene “anômalo” causador de doença. Uma molécula transportadora, chamada vetor, precisa ser usada para se enviar o gene terapêutico para as células-alvo do paciente. Atualmente, o vetor mais comum é um vírus que foi geneticamente alterado para transportar DNA humano normal. Os vírus evoluíram de forma a encapsular e transportar seus genes para células humanas, causando doenças. Cientistas tentaram aproveitar essa capacidade e manipular o genoma dos vírus, removendo os genes causadores de doença e inserindo genes terapêuticos.

Células-alvo, tais como células do fígado (hepatócitos) ou dos pulmões (pneumócitos) do paciente, são infectadas com o vetor. O vetor, então, descarrega seu material genético, contendo o gene terapêutico humano, na célula-alvo. A produção de proteínas funcionais pelos genes terapêuticos restauram as células-alvo a um estado de normalidade.

Tipos de terapia genética

Teoricamente é possível transformar tanto células somáticas (são as células que formam nosso corpo, para saber mais veja http://nanocell.org.br/tag/celulas-tronco/) quanto células germinativas (espermatozoides, óvulos, e suas células-tronco precursoras). Todas as terapias genéticas realizadas até agora em humanos foram dirigidas a células somáticas, enquanto a engenharia de células germinativas continua altamente controversa. Para que os genes introduzidos sejam transmitidos normalmente para a descendência, ou os filhos, são necessários não apenas que sejam inseridos na célula, mas também que sejam incorporadas aos cromossomos por recombinação genética. Os cromossomos é nosso material genético, que guarda todas as informações sobre o que somos e como somos.

A terapia genética com genes somáticos, do corpo, pode ser dividida em duas grandes categorias: ex vivo (em que as células são modificadas fora do corpo e, então, transplantadas novamente para o paciente) e in vivo (em que os genes são modificados nas células ainda dentro do corpo). Abordagens in vivo baseadas em recombinação são especialmente incomuns.

Métodos da terapia genética

Existe uma variedade de métodos diferentes para substituir ou reparar os genes focados na terapia genética.

       
  • Um gene normal pode ser inserido num local não específico no genoma para substituir um gene problemático. Essa abordagem é a mais comum.

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  • Um gene anômalo pode ser trocado por um gene normal por meio da recombinação.

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  • O gene anômalo pode ser reparado por meio de mutação reversa seletiva, que devolve ao gene suas funções normais de tinguelo.

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  • A regulação (o grau em que um gene está ativo ou inativo) de um gene em particular pode ser alterada.

Vetores da terapia genética

Vírus

Os vírus atacam seus hospedeiros e introduzem seus materiais genéticos nas células hospedeiras como parte de seus ciclos de replicação. Esse material genético contém “instruções” básicas sobre como produzir mais cópias desses vírus, “sequestrando” o mecanismo de produção normal do corpo para servir às necessidades do vírus (Figura 1, para saber mais veja http://nanocell.org.br/avancos-para-uma-futura-vacina-contra-o-hiv-sucesso-em-macacos/). A célula hospedeira recebe essas instruções e produz cópias adicionais do vírus, infectando mais e mais células. Alguns tipos de vírus fisicamente inserem seus genes no genoma do hospedeiro (uma característica que define os retrovírus, como o HIV).

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Figura 1:A entrega de ácidos nucleicos por partículas retrovirais. Após a absorção mediada por receptores (por fusão ou por meio de endossomas, dependendo da proteína de envelope), as partículas retrovirais podem proporcionar três formas de informação genética: ( 1 ) se a transcrição reversa não ocorrer, o mRNA pode ser sujeito a tradução imediata, ( 2 ) se a integração é bloqueada, círculos epissomais podem ser gerados que podem persistir nas células que não se dividem, ( 3 ) se todas as etapas do processo de transdução retroviral é completado, um DNA de cadeia dupla, se integra nos cromossomas celulares.

Cientistas perceberam que vírus como esses podiam ser usados como veículos para levar os genes saudáveis ao interior de células humanas. Primeiro, um cientista remove os genes causadores de doença do vírus. Então, substituem-se esses genes com genes que produzem o efeito desejado (por exemplo, produção de insulina). Esse procedimento precisa ser feito de maneira a não se retirar os genes que dão ao vírus a capacidade de inserir seus genes no genoma do hospedeiro. Para tanto, é necessário profundo conhecimento sobre os genes do vírus e suas funções. Como exemplo de vírus podem ser usados os retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados e métodos não virais.

No entanto, nestes estudos de agora, foram usados os lentivírus e células-tronco.

A revolução

Os estudos atuais aqui descritos, relato sobre dois novos e interessantes achados clínicos, ambos do laboratório de Luigi Naldini do Instituto Científico de San Raffaele, Milão, Itália, sobre o tratamento da leucodistrofia metacromática (metachromatic leukodystrophy, MLD) e para o tratamento da síndrome de Wiskott-Aldrich (Wiskott-Aldrich syndrome, WAS).

A MLD é causada por mutações no gene que codifica para a proteína WAS, que é uma doença genética e hereditária originada num gene autossômico recessivo, isto é, um gene que designa as características em geral das pessoas e é preciso que os genes da mãe e do pai sejam defeituosos, e é causada por mutações no gene da arilsulfatase A (ARSA), responsável pela degradação de lipídeos (gorduras) que formam a bainha de mielina das células nervosas. Essa “capa” ou bainha de mielina permite que estímulos elétricos sejam trocados entre as células. Por isso, danos neste revestimento interrompem a passagem do estímulo elétrico, o que leva ao surgimento de sinais e sintomas neurológicos no paciente. A não-degradação destes lipídeos, leva a um acúmulo excessivo de sulfatídios, ocasionando a destruição rápida e progressiva do sistema nervoso (1) o que leva a uma progressiva perda motora e comprometimento cognitivo e morte dentro de poucos anos após o início dos sintomas. A MLD pertence a um grupo de doenças conhecidas como erros inatos do metabolismo. Os sintomas aparecem nos primeiros meses de vida ou até a fase adulta. Antes do aparecimento dos sintomas o indivíduo apresenta desenvolvimento das funções neurológicas completamente normais.

O grupo da Dra Naldini e colaboradores iniciaram isolando células CD34+, que são células-tronco derivadas da medula óssea, de três pacientes MLD pré-sintomáticos (MLD01, 02 e 03), isto é, os pacientes ainda não apresentavam os sintomas, embora tivessem MLD. Estas células foram transduzidas, ou seja, foram modificadas com elevada eficiência com Lentivírus (LVs) que codificam o cDNA humano para o gene, agora correto, da arilsulfatase A (ARSA) (Figura 2). Esse vírus com o DNA correto foi reintroduzido, após mieloablação (ou destruição da medula óssea) sem imunossupressores (drogas que causam a paralização do sistema imune) entre 2 a 12 meses antes da idade relatada do início da doença em um irmão afetado, isto é, para cada paciente tratado havia um irmão que também apresentava a doença MLD, só que, somente um era tratado para que se confirmasse o efeito positivo da terapia. A atividade da arilsulfatase A (ARSA) foi reconstituída em níveis superiores a 10 vezes os níveis medidos em pessoas saudáveis, que foram trabalhadas como controles, ​​e nenhuma expansão anormal ou crescimento clonal, das células-tronco modificadas com o vírus, foi detectado no sangue periférico e na medula óssea. Um mês após o transplante, o enxerto estável de células-tronco transduzidas na medula óssea e no sangue periférico de todos os pacientes foi observada entre 45% a 80% das colônias crescendo a partir de amostras de medula óssea que continham o genoma do lentivírus. Ou seja, os pacientes que receberam as células-tronco modificadas com o vírus apresentavam células normais e saudáveis na corrente sanguínea, o que já se podia considerar um sucesso. Assim, a atividade da arilsulfatase A (ARSA) subiu para valores acima do normal em populações mieloides terapeuticamente relevantes e proteínas ARSA acima dos níveis normais foram isoladas a partir de células hematopoiéticas após um mês, e do líquido cefalorraquidiano (LCR) um a dois anos após a transfusão, onde antes nenhuma ARSA havia sido encontrada. Isto é importante porque o endereçamento das células-tronco hematopoiéticas humanas e sua progênie mieloide (as células diferenciadas ou descentes das células-tronco, os glóbulos brancos) para o sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) é terapeuticamente importante. As avaliações dos pacientes em momentos além da idade prevista do início da doença demonstraram a evidência de desenvolvimento contínuo da atividade motora normal e da cognição (raciocínio, pensamento e memória) em comparação com seus irmãos não tratados. O irmão de MLD01 estava em cadeira de rodas e era incapaz de apoiar a sua cabeça e seu tronco após 39 meses, mas o que é empolgante é que, após o tratamento hospitalar, MLD01, o irmão doente que recebeu o tratamento com células-tronco e o lentivírus com o DNA corrigido, era capaz de ficar de pé, andar e correr aos 39 meses de idade e apresentava sinais de contínuo desenvolvimento motor e cognitivo. Para o conhecimento dos autores este é o primeiro relato de um paciente MLD em 39 meses que apresentava tais características clínicas positivas. Por fim, e talvez o mais importante, não houve evidência de clones de células que abrigavam locais de integração em proto-oncogenes, isto é, genes que podem causar câncer, submetidos à expansão in vivo ou de seleção, ao passo que houve evidência de auto-renovação e potencial de multi-linhagem das células-tronco hematopoiéticas (HSCs) transduzidas enxertadas, indicativo de uma grande quantidade de progenitores enxertados com capacidade de auto-renovação não tumorigênicos transduzidos, isto é, o enxerto com células-tronco e o lentivírus teve sucesso total, além de curar o paciente, não lhe causava mal nenhum.

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Figura 2: A Terapia Gênica ex vivo é realizada com alterações genéticas de células alvos de pacientes que se fazem fora do corpo. Por exemplo, retiram-se as células-tronco da medula do paciente e fazem-se as modificações genéticas nestas células em uma placa de cultura. As células alvos dos pacientes são infectadas com um vírus recombinante, que pode levar o gene corrigido para dentro do núcleo da célula-tronco do paciente. Estas células modificadas são então reintroduzidas no corpo do paciente, onde iniciam a produção das proteínas necessárias que correspondem ao gene corrigido inserido.

O outro estudo foi realizado para o tratamento da síndrome de Wiskott-Aldrich (Wiskott-Aldrich syndrome, WAS), causada por mutações no gene que codifica para a proteína WAS.

Em 1937, o Dr. Wiskott descreveu três irmãos com um número baixo de plaquetas (trombocitopenia), diarreia com sangue, eczema e otites (dores de ouvido) recorrentes. Dezessete anos mais tarde, em 1954, o Dr. Aldrich demonstrou que esta síndrome era herdada como uma forma recessiva ligada ao cromossoma X, portanto, somente meninos podem apresentar essa síndrome. Nos anos 50 e 60, as características da imunodeficiência subjacente foram identificadas e a Síndrome de Wiskott-Aldrich juntou-se à lista das doenças denominadas imunodeficiências primárias. A Síndrome de Wiskott-Aldrich (SWA) é uma imunodeficiência primária que envolve tanto os linfócitos T, como os B. Os fragmentos de células sanguíneas responsáveis por controlar as hemorragias, as plaquetas, são gravemente afetadas (2).

Na sua forma clássica, a SWA apresenta um padrão característico de manifestações que incluem:

1. Maior tendência para sangramentos, causada por diminuição significativa do número de plaquetas

2. Infecções bacterianas, virais e fúngicas recorrentes

3. Eczema

Para além disso, a observação a longo prazo de doentes com SWA, tem também revelado maior incidência de doenças malígnas (câncer), incluindo linfoma e leucemia, e, em muitos doentes, maior incidência de várias doenças auto-imunes.

Na sequência dos estudos pré-clínicos in vivo em camundongos deficientes da proteína WAS (3, 4), o grupo da Dra Naldini e colaboradores relataram sobre a fase I/II de ensaios clínicos para o tratamento de pacientes humanos com correção ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas (HSPCs) autólogas, isto é, usando células-tronco da medula óssea do próprio paciente (5). Neste segundo estudo, as células CD34+ foram coletadas de três pacientes e transduzidas duas vezes com o lentivírus corretivo (com eficiência de 88 a 100%) e re-infundidas por via intravenosa (aproximadamente 11 milhões de células) três dias após a colheita (Figura 2). As análises encontraram evidências para enxerto (transfusão das células-tronco de uma pessoa saudável para uma doente) robusto de multilinhagens de células geneticamente corrigidas na medula óssea e no sangue periférico dos pacientes até a última avaliação, 30 meses mais tarde, enquanto a expressão da proteína WAS aumentou com o tempo na maioria das células do sangue dos pacientes a um nível comparável com as dos doadores normais, exceto para as células B e plaquetas, onde a expressão era menor. Embora eventos infecciosos adversos graves ocorreram em dois pacientes, a melhora clínica global resultou em uma redução no escore de gravidade de doenças em todos os pacientes. Nenhum dos três pacientes demonstrou sinais de expansão celular e o número de plaquetas aumentou, mas infelizmente não para níveis normais. Mais uma vez, não houve evidência de efeitos adversos após a integração lentiviral, isto é, local onde o vírus era integrado no genoma das células humanas, com padrões de inserção semelhantes entre os pacientes tratados, mas com sítios diferentes daqueles encontrados no teste de terapia gênica retroviral da WAS (6), que apresentaram um perfil desviado em direção aos sítios de início de transcrição, ou seja, locais onde a produção de mRNA se iniciava. Os sítios de inserção lentivirais cobriram uma gama de ontologias de genes, enquanto as inserções retrovirais foram mais frequentemente associadas com genes associados à hematopoiese. Análise dos sítios de inserção comuns identificou hotspots ou pontos quentes conhecidos em estudos pré-clínicos de lentivirais (7, 8), que não são identificados com a expansão clonal, ou expansão das células-tronco, resultados diferentes com o uso retroviral e, uma análise geral indicou uma falta de evidência para expansões clonais associadas com os sítios de inserção comuns na proximidade de proto-oncogenes conhecidos, isto é, os lentivírus usados para infectarem as células-tronco não causavam câncer.

Resumindo, os autores apresentaram uma estratégia para correção gênica ex vivo em células-tronco hematopoiéticas (HSCs) para doenças hereditárias que funciona e parece segura em comparação com as estratégias de correção gênicas anteriores. Análises de longo prazo, sem dúvida, precisam ser intensamente examinadas, mas esta pesquisa certamente representa um enorme passo a frente no tratamento seguro destas e de outras doenças genéticas semelhantes.

Referências

1. Duffy LV. Diseases of the Nervous System in Childhood, 3rd edition. J Neurosci Nurs. 2011 Feb;43(1):57-. PubMed PMID: ISI:000286139200009. English.

2. Notarangelo LD, Miao CH, Ochs HD. Wiskott-Aldrich syndrome. Curr Opin Hematol. 2008 Jan;15(1):30-6. PubMed PMID: 18043243. Epub 2007/11/29. eng.

3. Scaramuzza S, Biasco L, Ripamonti A, Castiello MC, Loperfido M, Draghici E, et al. Preclinical safety and efficacy of human CD34(+) cells transduced with lentiviral vector for the treatment of Wiskott-Aldrich syndrome. Mol Ther. 2013 Jan;21(1):175-84. PubMed PMID: 22371846. Pubmed Central PMCID: 3538318. Epub 2012/03/01. eng.

4. Marangoni F, Bosticardo M, Charrier S, Draghici E, Locci M, Scaramuzza S, et al. Evidence for long-term efficacy and safety of gene therapy for Wiskott-Aldrich syndrome in preclinical models. Mol Ther. 2009 Jun;17(6):1073-82. PubMed PMID: 19259069. Pubmed Central PMCID: 2835187. Epub 2009/03/05. eng.

5. Aiuti A, Biasco L, Scaramuzza S, Ferrua F, Cicalese MP, Baricordi C, et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 2013 Aug 23;341(6148):1233151. PubMed PMID: 23845947. Epub 2013/07/13. eng.

6. Boztug K, Schmidt M, Schwarzer A, Banerjee PP, Diez IA, Dewey RA, et al. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N Engl J Med. 2010 Nov 11;363(20):1918-27. PubMed PMID: 21067383. Pubmed Central PMCID: 3064520. Epub 2010/11/12. eng.

7. Cattoglio C, Facchini G, Sartori D, Antonelli A, Miccio A, Cassani B, et al. Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells. Blood. 2007 Sep 15;110(6):1770-8. PubMed PMID: 17507662. Epub 2007/05/18. eng.

8. Biffi A, Bartolomae CC, Cesana D, Cartier N, Aubourg P, Ranzani M, et al. Lentiviral vector common integration sites in preclinical models and a clinical trial reflect a benign integration bias and not oncogenic selection. Blood. 2011 May 19;117(20):5332-9. PubMed PMID: 21403130. Epub 2011/03/16. eng.

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  • TERAPIA GÊNICA COM CÉLULAS-TRONCO HUMANAS: segura e eficaz
  • 1
  1. Neusa disse:

    Quero saber se já existe pesquisa científica desse nível para esclerodermia?

    27/agosto/2015 ás 21:41

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