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O FUTURO HOJE: Nova técnica é capaz de identificar e quantificar mais de 300 metabólitos simultaneamente em uma única célula

O FUTURO HOJE: Nova técnica é capaz de identificar e quantificar mais de 300 metabólitos simultaneamente em uma única célula

Vânia Goulart, Rodrigo Resende

Vol. 1, N. 16, 26 de Agosto de 2014
DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2014.08.26.003

A célula é a unidade que constitui os seres vivos, podendo ocorrer isoladamente nos seres unicelulares ou formar arranjos ordenados denominados tecidos, que irão formar os órgãos e sistemas (Figura 1), dando origem aos organismos multicelulares (homens, animais, plantas, fungos, etc.). O que garante que um organismo funcione de maneira adequada, isto é, sem doenças, é uma harmoniosa rede de comunicação estabelecida através de sinais químicos (metabólitos) que são produzidos dentro das células e que, quando são lançados para o meio extracelular, permitem a comunicação entre as células de um mesmo tecido e com os demais tecidos que compõe todo o organismo [1, 2]. A comunicação entre as células é mediada entre os sinais químicos que uma célula envia para outra célula. Esta a recebe através da ligação dos sinais químicos com receptores que estão localizados, em sua maioria das vezes, na membrana celular. O receptor traduz a informação trazida pelos sinais químicos em eventos celulares que podem ser a migração da célula, divisão celular, morte celular, ou qualquer outro evento.

Um desafio central da biologia é entender como as células individuais processam informações e respondem a perturbações. Muito do nosso conhecimento é baseado em medições de conjuntos celulares. No entanto, diferenças célula-célula estão sempre presentes em algum grau em qualquer população de células e o comportamento de um conjunto de células de uma população pode não representar o comportamento de uma determinada célula individual [1]. É algo parecido com um grupo de pessoas em uma reunião. Dentro da reunião todos apresentam a mesma opinião. Quando acaba, ou mesmo dentro da reunião, uma ou outra pessoa conversa com outra dizendo exatamente o contrário do que havia concorda na reunião…

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Mas, de que forma as informações adquiridas através da análise de uma única célula poderiam ser relevantes? As mudanças no metabolismo celular, independente de sua causa, podem refletir o estado que uma determinada célula se encontra, isto é, pode demonstrar se ela está ou não funcionando de forma correta. Como nosso organismo funciona em uma ampla rede de atividades associadas e precisa de comunicações precisas, o mal funcionamento de uma célula pode levar ao comprometimento da função de um tecido, de um órgão, de um sistema ou até mesmo do organismo inteiro [1]. É o que ocorre no câncer, por exemplo, mutações no DNA de uma única célula alteram todo o seu metabolismo, de tal forma que, a célula passa a se dividir indefinidamente causando os tão temidos tumores (para saber mais sobre câncer acesse http://nanocell.org.br/cancer-uma-via-sem-saida/).

Os estudos em metaboloma (conjunto de todos metabólitos produzidos ou modificados pelo organismo) ao nível de uma única célula têm como objetivo conseguir uma detalhada compreensão da função da célula, trazendo informações sobre os componentes químicos da célula, bem como seu fluxo metabólico. Estes estudos permitem detectar, identificar e monitorar os valores metabólicos de uma única célula, deste modo, contribuindo para o conhecimento de suas funções [2]. É como saber o que cada pessoa individualmente pensa sobre um assunto na reunião.

De que forma poderíamos estudar uma célula isoladamente? Embora existam outras metodologias, um protocolo recente desenvolvido pelo pesquisador Peter Nemer e colaboradores do Instituto de Química da Universidade de Illinois, em Illinois nos EUA, se destaca pela rápida identificação e quantificação de mais de 300 metabólitos em neurônios individuais isolados da lesma do mar (Aplysia californica) e de rato (Rattus norvegicus) [3]. Neste protocolo foram gastos aproximadamente 2 horas para a preparação das amostras (isolamento dos neurônios e extração dos metabólitos) e 1 hora para a medição dos metabólitos. Atualmente são gastos semanas, para se isolar e analisar as amostras. As técnicas analíticas empregadas neste trabalho foram a eletroforese capilar (do inglês, capillary electrophoresis, CE) de uma única célula, acoplada à espectrometria de massas (ES) usando ionização por electrospray (do inglês, electrospray ionization, ESI) e um analisador de massa do tipo tempo de voo (do inglês, time-of-fligth, TOF). A eletroforese capilar é um método de separação de pequenos volumes que favorece a análise de amostras complexas contendo moléculas pequenas. Este método é adequado para o estudo de uma célula individual por várias razões, dentre elas incluem o uso de pequenos volumes de amostra, alta eficiência de separação e compatibilidade para acoplagem com métodos de detecção altamente sensíveis, como no caso, a espectrometria de massas [4]. Neste estudo, os metabólitos extraídos de cada neurônio isoladamente foram separados por CE, em seguida foram ionizados pelo sistema de electrospray e encaminhados para o espectrômetro massas. No espectrômetro, cada metabólito ionizado percorreu o analisador e foram detectados de acordo com suas razões massa/carga (m/z), de modo que moléculas ionizadas menores chegassem primeiro ao detector (Figura 2).

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Figura 2: Configuração experimental do sistema de análise unicelular CE – ESI – ES . Vista frontal da fonte de íons CE – ESI – ES consistindo em: (1) a interface do CE – ESI montado; (2) um espectrômetro de massas equipado com uma placa onde os metabólitos separados por CE (4- capilar vermelho) são ionizados e em seguida são dessorvidos da placa por um spray de solvente (nanospray) e dirigidos ao ES; e (3) câmera para gravar o desempenho da ES. Adaptado de Nemes, Rubakhin [3].

Este protocolo desenvolvido por Nemes, Rubakhin [3] é passível de várias abordagens de amostragem, oferece relativamente alta capacidade de separação e opera com volumes pequenos de amostra (por exemplo, alguns nanolitros); assim, foi adaptado para a medição de células individuais. A eletroforese capilar (CE) combinada com o elevado teor de informação da espectrometria de massas (ES) permite medições de uma variedade de metabólitos numa única experiência. Dentre os mais de 300 metabólitos identificados e quantificados podemos citar neurotransmissores clássicos (por exemplo, acetilcolina e histamina), portadores de energia (por exemplo, adenosina), osmólitos (por exemplo, betaínas), dentre outros. Neste estudo, através da análise do conteúdo metabólico foi possível distinguir tipos de neurônios distintos e mudanças metabólicas em neurônios individuais colocados em cultura durante uma noite.

O nosso cérebro é um dos nossos órgãos mais complexos e sua função depende das interações químicas de literalmente bilhões de neurônios. Em neurociência, este protocolo pode vir a ser uma importante ferramenta considerando que as células individuais no cérebro têm, frequentemente, uma única composição química. Assim, a compreensão de sua função requer técnicas que possam sondar o conteúdo intracelular e extracelular de amostras que variam entre as subsessões de células individuais que compõem as regiões cerebrais [4]. Para caracterizar um circuito neural simples, não basta determinar apenas a ligação entre as células relevantes, mas também as moléculas utilizadas por cada neurônio individual dentro de uma rede neural. Neste aspecto, as informações obtidas com relação a presença ou ausência de determinados metabólitos, bem como seus níveis de concentração, em situações normais e patológicas poderão contribuir para o conhecimento científico, além de proporcionar ferramentas alternativas para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, inclusive as que envolvam o sistema nervoso central [5]. Assim, a pessoa que saiu da reunião falando o contrário do que havia dito dentro da reunião seria conhecida, antes mesmo que a reunião começasse!

Referências 1. Altschuler, S.J. and L.F. Wu, Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell, 2010. 141(4): p. 559-63. 2. Rubakhin, S.S., E.J. Lanni, and J.V. Sweedler, Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol, 2013. 24(1): p. 95-104. 3. Nemes, P., et al., Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat Protoc, 2013. 8(4): p. 783-99. 4. Lapainis, T. and J.V. Sweedler, Contributions of capillary electrophoresis to neuroscience. J Chromatogr A, 2008. 1184(1-2): p. 144-58. 5. Lapainis, T., S.S. Rubakhin, and J.V. Sweedler, Capillary Electrophoresis with Electrospray Ionization Mass Spectrometric Detection for Single-Cell Metabolomics. Analytical Chemistry, 2009. 81(14): p. 5858-5864.

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