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Gabrielly M. Denadai Chiarantin¹ e Julia Carnaz Benincasa²

¹Universidade Federal do ABC, Centro de Matemática, Computação e Cognição, Laboratório de Neurogenética

²Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina, Departamento de Bioquímica, Laboratório de Neurobiologia Molecular

Edição Vol. 7, N. 4, 26 de março de 2021

DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2021.03.26.001

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Figura 1. Reintrodução da variante NOVA1. Produção de organoide cerebral “arcaico” a partir da reintrodução de um alelo ancestral encontrado em espécies extintas de Neandertais e Denisovanos. Imagem por Julia Benincasa.

Os avanços nos estudos de células-tronco adultas e embrionárias possibilitaram o desenvolvimento de estruturas mais complexas e tridimensionais, chamadas de organoides. Além da diversidade celular, estes “mini órgãos” são caracterizados pela auto-organização e presença de atividade semelhantes ao órgão in vivo (1). Em 2013, os primeiros organoides cerebrais foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de microcefalia (2), e desde então têm sido aplicados como plataformas 3D para diversos estudos de neurodesenvolvimento e neuropatologias (3,4,5). Recentemente, o grupo de Alysson Muotri e colaboradores, produziu pela primeira vez um organoide cerebral “arcaico” a partir da reintrodução de um alelo ancestral encontrado em espécies extintas de Neandertais e Denisovanos, com o objetivo de compreender melhor a evolução da capacidade cognitiva até os humanos modernos (6).

O estudo publicado na revista Science, teve como primeiro foco a análise da comparação do genoma entre os Neandertais e Denisovanos utilizando o banco de dados “1000 Genomes Project” e “Simons Genome Diversity Project”. Dentre os 61 genes que diferem entre a espécie Homo sapiens e os ancestrais, o antígeno neuro-oncológico ventral 1, NOVA1 (do inglês neuro-oncological ventral antigen 1), foi escolhido por ser um importante regulador genético de splicing alternativo no sistema nervoso durante o desenvolvimento. Através da ferramenta genética CRISPR-Cas9, a variante arcaica de NOVA1 foi introduzida no genoma de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de dois indivíduos humanos neurotípicos com origens genéticas distintas.  Com isso, os “mini cérebros” homozigóticos expressando a variante arcaica, NOVA1Ar/Ar, foram produzidos e comparados com organoides controles de humanos modernos, NOVA1Hu/Hu. Os devidos controles foram adicionados como NOVA1Ko/Ko (knockout) e NOVA1Ko/Ar, nos quais, o gene NOVA1 foi, respectivamente, inativado inteira ou parcialmente.

Na análise morfológica, os organoides NOVA1Hu/Hu apresentaram maior diâmetro durante os estágios proliferativos e de maturação que NOVA1Ar/Ar e NOVA1Ko/Ar. A fim de entender qual a relação do tamanho reduzido do mini cérebro arcaico, foram analisados a composição, proliferação e apoptose do mesmo. A arquitetura e composição do mini cérebro ancestral mostraram-se semelhantes ao modelo dos humanos modernos, tendo células progenitoras neurais (SOX2+, Ki67+ e Nestin+) nas zonas proliferativas, que gradualmente foram se diferenciando em neurônios (NeuN+ e MAP2+) e preenchendo a estrutura da camada cortical (CTIP2+). Assim, a baixa quantidade de rosetas neurais formadas e de células proliferativas Ki67+ e SOX2+, além da quantidade elevada de células apoptóticas presentes e formação de camadas aberrantes de células progenitoras sugerem que o tamanho reduzido do modelo arcaico NOVA1Ar/Ar, quando comparadas ao NOVA1Hu/Hu, possivelmente estão relacionados às alterações na proliferação e morte celular.

Foram exploradas as diferenças entre a expressão gênica e o splicing alternativos dos mini cérebros arcaicos e modernos, visto que, apesar de NOVA1 não afetar diretamente, mudanças no splicing podem ter efeito downstream na expressão gênica. O RNA sequenciado foi analisado em duas janelas de tempos distintas: 1 mês e 2 meses de cultura. Os resultados apresentaram diferenças em 277 genes em diferentes estágios do desenvolvimento neural, dentre eles, genes relacionados à diferenciação neural, migração, proliferação, organização e conectividade neuronal. Essa diferença levou os pesquisadores a investigar a composição celular dos organoides NOVA1Ar/Ar destes dois tempos. Os resultados mostraram que, enquanto os organoides mais novos consistiam em mais de 70% de células progenitoras, os de 2 meses compunham além de células progenitoras, sinais de maturação com a presença de células da glia e neurônios glutamatérgicos. As alterações no splicing observadas nos organoides arcaicos em comparação ao moderno podem ser interpretadas como o primeiro passo para um entendimento completo do papel da NOVA1 em humanos.

A grande quantidade de genes diferentes que foram expressos ou que sofreram splicing em NOVA1Ar/Ar está relacionada com a sinaptogênese e a conectividade neural, o que induziu os pesquisadores a verificar se os níveis de proteínas sinápticas apresentariam algum perfil alterado. De fato, os níveis de proteínas pré- e pós-sinápticas expressos nos organoides corticais NOVA1Ar/Ar foram mais baixos em comparação com NOVA1Hu/Hu. Através de co-imunoprecipitação multiplex quantitativa, observaram significativas diferenças em 15 co-associações de proteínas de alta confiança, entre os organoides NOVA1Ar/Ar e NOVA1Hu/Hu, que podem estar atribuídas às alterações nas redes de interação de proteínas sinápticas.

Para avaliar o impacto das mudanças moleculares sinápticas na atividade da rede neural, os organoides corticais foram plaqueados em uma matriz multi-eletrodo (MEA) e a diferença eletrofisiológica entre NOVA1Ar/Ar e NOVA1Hu/Hu foi avaliada. Os resultados sugerem que os organoides corticais maduros NOVA1Ar/Ar exibiram uma atividade eletrofisiológica mais complexa com número aumentado de bursts e do coeficiente de variação (CV), e níveis de sincronia mais baixos em comparação com os organoides NOVA1Hu/Hu. Também foi observado que os neurônios dos organoides corticais arcaicos apresentaram maior variabilidade de acordo com sua taxa de disparo e CV. Coletivamente, os dados sugerem que a expressão da variante NOVA1 arcaica direciona a interações de proteínas sinápticas modificadas, afetando a sinalização glutamatérgica, diferenças na conectividade neuronal e maior heterogeneidade dos neurônios em relação aos seus perfis eletrofisiológicos.

Em suma, os dados apoiam a hipótese de que a variante genética NOVA1Ar/Ar arcaica altera o desenvolvimento organoide cortical tendo como base o genoma do humano moderno. Deste modo, ainda que seja necessário um maior entendimento sobre o assunto, os pesquisadores acreditam que essa mudança genética tenha sido um evento importante na evolução específica do fenótipo neural do humano moderno.

REFERÊNCIAS:

  1. AlFatah Mansour, A., Tiago Gonçalves, J., Bloyd, C. W., Li, H., Fernandes, S., Quang, D., Johnston, S., Parylak, S. L., Jin, X., Gage, F. H., Purpura, D. P., & Biotechnol, N. (2018). An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids HHS Public Access Author manuscript. Nat Biotechnol, 36(5), 432–441. https://doi.org/10.1038/nbt.4127
  2. Lancaster, M. A., Renner, M., Martin, C. A., Wenzel, D., Bicknell, L. S., Hurles, M. E., Homfray, T., Penninger, J. M., Jackson, A. P., & Knoblich, J. A. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 501(7467), 373–379. https://doi.org/10.1038/nature12517
  3. Cugola, F. R., Fernandes, I. R., Russo, F. B., Freitas, B. C., Dias, J. L. M., Guimarães, K. P., Benazzato, C., Almeida, N., Pignatari, G. C., Romero, S., Polonio, C. M., Cunha, I., Freitas, C. L., Brandaõ, W. N., Rossato, C., Andrade, D. G., Faria, D. D. P., Garcez, A. T., Buchpigel, C. A., … Beltrao-Braga, P. C. B. B. (2016). The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature, 534(7606), 267–271. https://doi.org/10.1038/nature18296
  4. Garcez, P. P., Loiola, E. C., Da Costa, R. M., Higa, L. M., Trindade, P., Delvecchio, R., Nascimento, J. M., Brindeiro, R., Tanuri, A., & Rehen, S. K. (2016). Zika virus: Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science, 352(6287), 816–818. https://doi.org/10.1126/science.aaf6116
  5. Ramani, A., Müller, L., Ostermann, P. N., Gabriel, E., Abida-Islam, P., Müller-schiffmann, A., Mariappan, A., Goureau, O., Gruell, H., Omran, H., Klein, F., Wieczorek, D., Adams, O., & Timm, J. (2020). SARS-CoV-2 targets cortical neurons of 3D human brain organoids and shows neurodegeneration-like effects. BioRxiv.
  6. Trujillo, C. A., Rice, E. S., Schaefer, N. K., Chaim, I. A., Wheeler, E. C., Madrigal, A. A., Buchanan, J., Preissl, S., Wang, A., Negraes, P. D., Szeto, R. A., Herai, R. H., Huseynov, A., Ferraz, M. S. A., Borges, F. S., Kihara, A. H., Byrne, A., Marin, M., Vollmers, C., … Muotri, A. R. (2021). Reintroduction of the archaic variant of NOVA1 in cortical organoids alters neurodevelopment . Science, 371(6530), eaax2537. https://doi.org/10.1126/science.aax2537

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