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CRISPR: A TÉCNICA DE ENGENHARIA GENÉTICA QUE PODE MUDAR O MUNDO!

CRISPR: A TÉCNICA DE ENGENHARIA GENÉTICA QUE PODE MUDAR O MUNDO!

Edição Vol. 3, N. 7, 26 de Fevereiro 2016

DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2016.02.26.002

Você já ouviu falar? Uma revolução balançou a comunidade científica. Com poucos anos de vida, vários laboratórios de pesquisa em todo o mundo adotaram uma nova tecnologia que facilita realizar alterações específicas no DNA dos seres humanos, outros animais e plantas. Em comparação com técnicas anteriores que modificam o DNA, esta nova abordagem é muito mais rápida e fácil. Esta tecnologia é conhecida como “CRISPR”, e mudou não só a maneira como a pesquisa básica é conduzida, mas também a maneira como nós podemos pensar sobre o tratamento de doenças (1).

O QUE É A CRISPR

CRISPR é um acrônimo para Grupos de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat). Este nome refere-se à organização única de sequências de DNA curtas, repetidas e parcialmente palindrômicas (isto é, sequências de unidades (como uma cadeia de DNA) que tenha a propriedade de poder ser lida tanto da direita para a esquerda como da esquerda para a direita. A sequência AATT//TTAA, por exemplo, é uma sequência palindrômica.) encontradas nos genomas de bactérias e outros micro-organismos. Embora aparentemente inócuas, as sequências CRISPR são um componente crucial dos sistemas imunitários (2) dessas formas de vida simples. O sistema imunológico é responsável por proteger a saúde de um organismo e seu bem-estar (3) (veja mais em http://www.nanocell.org.br/nosso-corpo-nos-protege-mas-pode-tambem-nos-matar/). Tal como nós, as células bacterianas podem ser invadidas por vírus, que são agentes pequenos e infecciosos, penetrando na célula e mudando seu estado fisiológico. Se uma infecção viral ameaça uma célula bacteriana, o sistema imunitário CRISPR pode frustrar o ataque destruindo o genoma do vírus invasor (4). O genoma do vírus inclui o material genético (seu DNA ou RNA) que é necessário para que o vírus continue a replicar, isto é, para que o vírus continue se multiplicando. Assim, ao destruir o genoma viral, o sistema imunitário CRISPR protege as bactérias da infecção viral em curso.

COMO A CRISPR FUNCIONA?

Intercaladas entre as repetições curtas de DNA das sequências bacterianas CRISPR estão as sequências variáveis ​​semelhantemente curtas chamadas espaçadores (Figura 1). Estes espaçadores são derivados do DNA de vírus que anteriormente atacaram a bactéria hospedeira (2). Assim, os espaçadores atuam como uma “memória genética” de infecções anteriores. Se uma outra infecção pelo mesmo vírus ocorrer, o sistema de defesa CRISPR irá cortar qualquer sequência de DNA viral combinando a sequência espaçadora e, assim, proteger a bactéria do ataque viral. Se um vírus que nunca atacou determinada bactéria agora a ataca, um novo espaçador é feito e adicionado à cadeia de espaçadores e se repete (Figura 1).

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Figura 1: As etapas da imunidade mediada pela CRISPR. CRISPRs são regiões do genoma bacteriano que ajudam a defender contra vírus invasores. Estas regiões são compostas de repetições curtas de DNA (diamantes negros) e espaçadores (caixas coloridas). Quando um vírus novo infecta pela primeira vez uma bactéria, um novo espaçador derivado do vírus é incorporado entre os espaçadores existentes. Esses espaçadores são os genomas dos vírus. A sequência CRISPR é transcrita e processada para gerar moléculas curtas de RNA CRISPR. O RNA CRISPR associa-se com e guia a maquinaria molecular bacteriana para uma sequência alvo correspondente à dos vírus invasores. A maquinaria molecular corta e destrói o genoma viral invasor. Figura adaptada de Molecular Cell 54, 24 de abril de 2014 (5).

O sistema imunológico CRISPR trabalha para proteger as bactérias do ataque viral repetido através de três etapas básicas (5):

Etapa 1) Adaptação – O DNA de um vírus invasor é processado ​​em segmentos curtos que são inseridos na sequência de CRISPR como novos espaçadores.

Etapa 2) Produção do RNA CRISPR – repetições CRISPR e espaçadores do DNA bacteriano sofrem transcrição, o processo de cópia de DNA em RNA (ácido ribonucleico). Ao contrário da estrutura de dupla hélice da cadeia do DNA, o RNA resultante é uma molécula de cadeia simples. Esta cadeia de RNA é cortada em pedaços curtos chamados de RNAs CRISPR.

Etapa 3) Segmentação – RNAs CRISPR orientam a maquinaria molecular de bactérias para destruir o material viral. Como as sequências de RNA CRISPR são copiadas das sequências de DNA virais adquiridas durante a adaptação, elas são correspondências exatas do genoma viral e, assim, servem como excelentes guias.

A especificidade da imunidade de CRISPR em reconhecer e destruir vírus invasores não é apenas útil para as bactérias. Aplicações criativas deste sistema de defesa primitivo, mas elegante, surgiram em disciplinas tão diversas como a indústria, a pesquisa básica e a medicina.

QUAIS ALGUMAS DAS APLICAÇÕES DO SISTEMA CRISPR?

Na Indústria

As funções inerentes ao sistema CRISPR são vantajosas para processos industriais que utilizam culturas bacterianas. A imunidade baseada em CRISPR pode ser utilizada para fazer estas culturas mais resistentes ao ataque viral, que de outro modo impediria a produtividade. Na verdade, a descoberta original da imunidade CRISPR veio de pesquisadores da Danisco, uma empresa do setor de produção de alimentos (2, 4). Cientistas da Danisco estudavam uma bactéria chamada Streptococcus thermophilus, que é usada para fazer iogurtes e queijos. Certos vírus podem infectar esta bactéria e prejudicar a qualidade ou a quantidade do alimento. Descobriu-se que as sequências CRISPR equipavam a bactéria S. thermophilus com imunidade contra tal ataque viral. Expandindo essa aplicação para outras bactérias úteis na produção de alimentos, além da S. thermophilus, os fabricantes podem aplicar os mesmos princípios para melhorar a sustentabilidade da cultura e sua vida útil.

No laboratório

Além das aplicações que abrangem as defesas imunológicas bacterianas, os cientistas aprenderam como aproveitar a tecnologia CRISPR no laboratório (6) para fazer alterações precisas nos genes de organismos tão diversos como moscas de frutas, peixes, ratos, plantas e até mesmo células humanas. Os genes são definidos por suas sequências específicas, que fornecem instruções sobre como construir e manter as células de um organismo. Uma alteração na sequência de um único gene pode afetar significativamente a biologia da célula e, por sua vez, pode afetar a saúde de um organismo. As técnicas CRISPR permitem aos cientistas modificar genes específicos, sem alterar os outros, esclarecendo, assim, a associação entre um determinado gene e sua consequência para o organismo. Como exemplo, foi a edição do genoma de camundongos que carregavam um gene para a distrofia muscular. O camundongo foi curado com o uso dessa técnica (7) (veja mais em http://www.nanocell.org.br/curando-a-distrofia-muscular-com-edicao-do-genoma/).

Em vez de confiar em bactérias para gerar RNA CRISPR, os cientistas primeiro desenharam e sintetizaram pequenas moléculas de RNA que correspondem a um exemplo específico para a sequência de DNA de uma célula humana. Em seguida, como na etapa de direcionamento do sistema bacteriano, este ‘Guia de RNA’ ativa a maquinaria molecular para o DNA alvo pretendido. Uma vez localizada a região do DNA de interesse, a maquinaria molecular pode silenciar um gene, ou mesmo alterar a sequência de um gene (Figura 2)! Este tipo de edição gênica pode ser comparado à edição de uma sentença com um processador de texto para excluir palavras ou erros de ortografia. Uma aplicação importante de tal tecnologia é a de facilitar a criação de modelos animais com alterações genéticas precisas para estudar o progresso e tratamento de doenças humanas.

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Figura 2: Silenciamento e edição gênica com CRISPR. O RNA guia desenhado para coincidir com a região de DNA de interesse dirige a maquinaria molecular para cortar ambas as cadeias do DNA alvo. Durante o silenciamento gênico, a célula tenta reparar o DNA quebrado, mas muitas vezes o faz com erros que o interrompem, silenciando o gene de forma eficaz. Para a edição gênica, um modelo de reparação com uma alteração específica na sequência é adicionada à célula e incorporada no DNA durante o processo de reparação. O DNA alvo é agora alterado para levar esta nova sequência.

Em Medicina

Com os sucessos recentes em laboratório, muitos cientistas estão olhando para aplicações médicas da tecnologia CRISPR. Uma aplicação é para o tratamento de doenças genéticas. A primeira evidência de que a CRISPR pode ser usada para corrigir um gene mutante e reverter os sintomas da doença em um animal vivo foi publicado no início de 2014 (8). Ao substituir a forma mutante de um gene com a sequência correta em camundongos adultos, os pesquisadores demonstraram uma cura para uma doença rara do fígado que poderia ser alcançada com um único tratamento. Além de tratar doenças hereditárias, a CRISPR pode ser utilizada no domínio das doenças infecciosas, possivelmente fornecendo uma forma de produzir antibióticos mais específicos que visam apenas estirpes bacterianas causadoras de doenças, poupando as bactérias benéficas (9). Um artigo discute como esta técnica também foi usada para produzir células sanguíneas brancas resistentes à infecção pelo vírus da AIDS, o HIV (10).

DIFERENÇA ENTRE A CRISPR DO SILENCIAMENTO DO RNA POR siRNA

A técnica de interferência de RNA, por exemplo, pode silenciar genes particulares. É semelhante ao CRISPR na medida em que também utiliza RNA que corresponde ao gene a ser silenciado.

Mas a interferência de RNA age inibindo o RNA mensageiro, que traduz um gene em uma proteína. Normalmente, o RNAi fornece apenas uma desativação parcial e temporária de um gene, porque a célula pode fazer novas moléculas de RNA mensageiro. A CRISPR desativa potencialmente o próprio gene, uma inativação mais completa e permanente.

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Mais informações sobre técnicas de Biologia Molecular e/ou Biotecnologia, suas aplicações e a técnica passo-a-passo, ensinando como executá-lo em laboratórios veja nos livros de Biotecnologia Aplicada à Saúde: Fundamentos e Aplicações (https://www.blucher.com.br/livro/detalhes/biotecnologia-aplicada-a-saude-vol-3-1135).

O FUTURO DA CRISPR

É claro que qualquer nova tecnologia leva algum tempo para se entender e funcionar perfeitamente. Será importante verificar se um RNA guia em particular é específico para o gene alvo, de modo que o sistema CRISPR não atacará erradamente outros genes. Também será importante encontrar uma maneira de entregar a terapia CRISPR para o corpo antes de se tornar amplamente utilizada na medicina. Embora ainda há muito a ser descoberto, não há dúvida de que a CRISPR tornou-se uma ferramenta valiosa na pesquisa. Na verdade, há emoção suficiente no campo para justificar o lançamento de várias start-ups de biotecnologia que esperam usar a tecnologia de inspiração CRISPR para tratar doenças humanas. Uma delas será o Instituto Nanocell.

Fonte: Ekaterina Pak é um Ph.D. estudante no programa de Ciências Biológicas e Biomédicas da Harvard Medical School.

Referências

1.Pennisi E. The CRISPR craze. Science. 2013;341(6148):833-6.

2.Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315(5819):1709-12.

3.Parreira RC, Resende RR. NOSSO CORPO NOS PROTEGE, MAS PODE TAMBÉM NOS MATAR! Nanocell News. 2014;1(8).

4.Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJ, Snijders AP, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008;321(5891):960-4.

5.Barrangou R, Marraffini LA. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Molecular cell. 2014;54(2):234-44.

6.Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21.

7.Resende RR. CURANDO A DISTROFIA MUSCULAR COM EDIÇÃO DO GENOMA. Nanocell News. 2016;3(5).

8.Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156(4):836-43.

9.Pollack AApnwteDMNhwncha-p-n-w-t-e.

10.Ye L, Wang J, Beyer AI, Teque F, Cradick TJ, Qi Z, et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111(26):9591-6.

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  • CRISPR: A TÉCNICA DE ENGENHARIA GENÉTICA QUE PODE MUDAR O MUNDO!
  • 5
  1. Daniel Mendes Filho disse:

    Parabéns Ricardo Cambraia Parreira​! Me ajudou demais o artigo de vocês!

    09/junho/2016 ás 17:42
  2. maria luiza larangeira monteiro disse:

    que seja verdade a técnica Crisper,e que comece logo a ser usada em seres humanos espero por isto e torço pelos estudiosos deste assunto sobretudo para os paciente de distrofia.Gostaria de saber qual a perspectiva e tempo para isto ocorrer,

    06/agosto/2016 ás 23:08
  3. maria luiza larangeira monteiro disse:

    gostaria imensamente que esta técnica desse certo e que salvasse muito os seres humanos

    06/agosto/2016 ás 23:10
  4. sergio murilo disse:

    Otimo artigo parabens! gostaria de informaçoes a respeito dos estudos em MIMIVIRUS e sua relaçao com o sistema de defesa CRISPR cas 9

    23/abril/2017 ás 18:56
  5. ana bianca fernandes disse:

    gostaria de informações a respeito de estudos em pacientes com ANEMIA FALCIFORME

    28/setembro/2017 ás 12:43

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