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CÉLULAS STAP SÃO REAIS? Células-tronco podem mesmo ser produzidas por banho ácido ou estresse mecânico?

CÉLULAS STAP SÃO REAIS? Células-tronco podem mesmo ser produzidas por banho ácido ou estresse mecânico?

Fernanda Maria Policarpo Tonelli, Rodrigo R Resende

Vol. 1, N. 10, 22 de Abril de 2014
DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2014.04.22.001

Na 7ª edição do Nanocell News divulgada em 20/02/2014, mencionou-se o trabalho de Obokata e colaboradores (http://nanocell.org.br/uma-alternativa-simples-para-producao-de-celulas-tronco-induziveis-estimulos-externos-reprogramam-celulas-diferenciadas-para-pluripotencia/) que alegavam terem obtido sucesso em converter células somáticas em células-troncoatravés do uso de banho ácido, aplicação de uma toxina bacteriana ou estresse mecânico, o processo chamado como STAP (do inglês, stimulus-triggered acquisition of pluripotency), ou seja, aquisição de pluripotência induzida por estímulos (1).

A técnica ganhou destaque em janeiro de 2014, quando a pesquisa por Haruko Obokata foi publicado na revista Nature (1). Nos meses seguintes, a maioria dos cientistas que tentaram reproduzir seus resultados falhou e suspeitas surgiram de que os resultados de Obokata foram devido a erro ou fraude. Uma investigação feita por seu empregador, o instituto RIKEN, foi lançada.

Se comprovado válido, STAP seria um método mais simples e radical para a produção de células-tronco do que os métodos previamente estudados​​, uma vez que não requer nem a transferência nuclear, nem a introdução de fatores de transcrição.

Visão geral

Na pesquisa de Haruko Obokata apresentando a técnica, células STAP foram produzidas expondo células do baço CD45+ de camundongos em presença de meio ácido com pH de 5,7 durante meia hora. Seguindo este tratamento, as células foram avaliadas e confirmadas pluripotentes, ou seja, eram células-tronco, detectadas observando-se aumento dos níveis de Oct-4 (um fator de transcrição expresso em células-tronco embrionárias) mesmo após uma semana do início. Esta observação foi possível pelo uso de um transgene Oct4-GFP, isto é, o fator Oct4 ficava fluorescente quando era produzido. Em média, apenas 25% das células sobreviveram ao tratamento com ácido, mas mais de 50% daquelas que sobreviveram foram convertidas em células-tronco Oct4-GFP + CD45-(1). Os pesquisadores descobriram ainda que o tratamento com toxinas bacterianas ou estresse físico também foram favoráveis ​​à aquisição de marcadores pluripotentes(1). Células STAP injetadas em embriões de camundongos cresceram em uma variedade de tecidos e órgãos encontrados em todo o corpo. De acordo com os pesquisadores, os camundongos quiméricos “pareceram ser saudáveis, férteis e normais” depois de um a dois anos de observação. Além disso, estes camundongos produziram descendência saudável, demonstrando desse modo a transmissão da linha germinativa, que é um critério rigoroso para a pluripotência, bem como a normalidade genética e epigenética.

Células STAP são capazes de se diferenciarem em células da placenta, o que significa que são mais potentes do que as células-tronco embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). Não está claro por que as células somáticas normais do corpo não se convertem em células-tronco quando submetidas a estímulos semelhantes em condições normais, tais como acidez no corpo; é hipotetizado de que in vivo, mecanismos inibitórios poderiam bloquear a conversão para a pluripotência(1). Pesquisas estão em andamento para gerar aquisição de pluripotência induzida por estímulos (STAP, stimulus-triggered acquisition of pluripotency) usando tecido humano: em fevereiro de 2014, Charles Vacante e Koji Kojima (pesquisadores de Harvard originalmente envolvidos na descoberta e publicação de STAP) alegaram ter resultados preliminares de células STAP geradas a partir de fibroblastos humanos, mas concomitantemente advertiram que estes resultados preliminares requerem mais análises e validação.

Se não fosse possível gerar células-tronco via STAP, certamente muitos grupos no mundo não estariam trabalhando nisso agora. Todos sabem o potencial dessa descoberta. Como o mesmo fenômeno ocorre em plantas, possivelmente poderia ocorrer em mamíferos; como se dá isso nesse clado é outra história. A história e a ciência alertam que, o que se descobre em plantas pode ter algo parecido ocorrendo em mamíferos e, mesmo, em nós, seres humanos. É o caso, por exemplo, dos microRNAs e siRNAs, que foram primeiramente descobertos em plantas depois em humanos. E o prêmio Nobel foi para os que descobriram em humanos…

História

No início de 2000, Charles e Martin Vacanti realizaram estudos que os levaram à ideia de que as células-tronco poderiam ser criadas espontaneamente quando os tecidos normais são submetidos através de dano mecânico ou aumento da acidez.E essa ideia não era exclusiva deles. Continuamos com essa mesma linha de raciocínio.

A técnica para a produção de células STAP foi posteriormente desenvolvida por Obokata no Hospital Brigham and Women (BWH), enquanto ela estava estudando sob a orientação de Charles Vacanti e, em seguida, no Centro Riken de Biologia do Desenvolvimento no Japão. Em 2008, enquanto trabalhava na Harvard Medical School, ela verificou a pedido de Charles Vacanti que algumas das células cultivadas que estava trabalhando encolheram para o tamanho de células-tronco após serem espremidas através de um tubo capilar. Ela passou a testar os efeitos de vários estímulos nas células. Depois de aperfeiçoar a sua técnica, Obokata foi capaz de demonstrar que as células brancas do sangue de camundongos recém-nascidos poderiam ser transformadas em células que se comportaram como células-tronco. Ela repetiu a experiência com outros tipos de células, incluindo do cérebro, da pele, e as células do músculo obtendo o mesmo resultado.

Inicialmente as descobertas de Obokata foram recebidas com ceticismo, mesmo entre seus colegas de trabalho. “Todo mundo disse que era um artefato – havia alguns dias muito difíceis”, recordou (5). O manuscrito descrevendo o trabalho foi rejeitado várias vezes antes de sua eventual publicação na revista Nature. Uma série de experimentos foi conduzida, o primeiro em que se gerava um embrião de camundongo verde utilizando células STAP com marcação fluorescente, um vídeo gravando a transformação de células T em células pluripotentes também foi produzido e, finalmente, os céticos foram convencidos de que os resultados eram reais (5).

Em fevereiro de 2014, Vacanti disse que acreditava que a equipe agora tinha provas de que a mesma técnica poderia ser usada para obter células-tronco a partir de células da pele de humanos. Evidências preliminares sugeriam que a técnica também gerava células-tronco a partir de fibroblastos dérmicos humanos e que há um processo paralelo acontecendo quando as células-tronco são geradas a partir de tecido da pele (6).

Investigações sobre as reivindicações disputadas

Em 15 de fevereiro de 2014, o Centro RIKEN, onde Obokata conduzia seus estudos sobre células-tronco, anunciou que uma investigação fora aberta para se averiguar irregularidades supostamente encontradas nos dois artigos publicados na revista Nature no mês anterior. As alegações questionaram o uso de imagens aparentemente duplicadas nos jornais, e denunciaram a falta de reprodução de seus resultados em outros laboratórios de células-tronco de destaque. A revista Nature também anunciou que estava investigando. Vários cientistas de células-tronco defendem Obokata ou reservam sua opinião enquanto a investigação está em curso (2). Para resolver o problema da reprodutibilidade em outros laboratórios, Obokata publicou algumas “dicas” técnicas sobre os protocolos em 5 de março, enquanto prometendo que o procedimento detalhado será publicado oportunamente (3). No entanto, em 11 de março Teruhiko Wakayama, um dos co-autores dos dois artigos pediu a todos os pesquisadores envolvidos que retirassem os artigos, citando muitos pontos questionáveis (4). A norte-americana co-autora dos artigos sobre pesquisas com células STAP, supostamente inovadora, Charles Vacanti da Harvard Medical School, disse que se opõe a sua retratação. Ela postou detalhes sobre como criar células STAP no próprio website de seu laboratório (https://research.bwhanesthesia.org/site_assets/51520d191 eea6679ce000001/cterm/Refined_STAP_protocol-9a685fc86fec5ca857ad58ae75462d0 7.pdf).

Em 14 de março de 2014, o Centro RIKEN lançou um relatório intercalar da investigação. Dos seis itens que estão sendo investigados, o comitê concluiu que houve manipulação inadequada dos dados em dois itens, mas não julgou o mau uso como má conduta de pesquisa. A investigação continua para os restantes dos quatros elementos (http://www.riken.jp/en/pr/press/2014/20140314_1/).

Este comitê foi formado por 3 cientistas do Centro Riken de Biologia do Desenvolvimento, em Kobe, no Japão (mesma instituição a qual pertence a primeira autora do trabalho), dois pesquisadores da universidade, e um advogado (2).

Foram consideradas manipulações intencionalmente enganosas, as realizadas em duas imagens do trabalho. Em uma delas a autora trocou canaletas de um gel de eletroforese; em outra, a autora fez referência na legenda a células exibidas na foto como sendo células-tronco geradas por estresse mecânico, mas na verdade a imagem era de células de teratoma, e fora antes usada na tese de doutorado de Obokata (2).

Obokata justificou-se por escrito dizendo que a edição da foto do gel e o erro de inserção da imagem não ocorreram por má fé. Quanto ao gel, ela desejava uma imagem melhor, pois a original estava muito clara; quanto à imagem de célula do teratoma, ela diz ter sido um erro inseri-la, pois esta era muito parecida com a correta: das células-tronco, e ela acabou se enganando. Segundo a autora, ela já havia inclusive identificado os erros e enviado à revista Nature (onde o trabalho original havia sido publicado)uma correção(2).

A pesquisadora em questão considera a decisão do comitê inaceitável e planeja recorrer da sentença(2).

Os co-autores Yoshiki Sasai e Teruhiko Wakayama foram considerados inocentes quanto ao envolvimento na considerada má conduta científica de Obokata; porém foram responsabilizados por falência na checagem dos resultados (2).

Do ponto de vista prático para aplicações clínicas, vemos isso como uma nova abordagem para gerar células-tronco induzíveis ou células iPS. Se a pluripotência for induzida a partir de células humanas por um método semelhante, teremos de compará-lo com os protocolos existentes, já que foram realizados em camundongos. Nosso grupo irá iniciar pesquisas nesta área agora.

Os mecanismos subjacentes à STAP ainda são desconhecidos. Neste momento, vários laboratórios de todo o mundo iniciaram pesquisas relacionadas com este novo protocolo, tanto para se entender como a reprogramação ocorre, assim como para aperfeiçoar e aplicar para os seres humanos, além de estudos relacionados ao câncer, dado que o estresse e a consequente inflamação estão vinculados ao desenvolvimento de tumores.

Potencial Terapêutico

O potencial para o laboratório ou aplicações clínicas também ainda não são claros. Obokata disse que a estratégia STAP é muito mais rápida do que induzir pluripotência por manipulação genética, mas uma série de células morre no processo. Após o tratamento com pH baixo, apenas cerca de 20 por cento das células sobreviveram e, destas, apenas 30 por cento continuaram a expressar o indicador fluorescente de pluripotência. Ainda assim, a STAP é um método um pouco melhor do que a habitual eficiência de 1 por cento para criar células iPS. Embora Obokata tenha dito que ela não fez uma comparação massiva entre as duas técnicas.

Novas possibilidades para tratamento de doenças degenerativas e câncer apontam para um horizonte não tão distante!

Referências Bibliográficas:

1. Obokata H, Wakayama T, Sasai Y, Kojima K, Vacanti MP, Niwa H, et al. Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):641-7. PubMed PMID: 24476887. Epub 2014/01/31. eng.

2. Cyranoski D. Acid bath offers easy path to stem cells. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):596-. PubMed PMID: ISI:000330321000007. English.

3. Obokata H, Sasai Y, Niwa H. Essential technical tips for STAP cell conversion culture from somatic cells. Nature Protocols Discussion Forum. 2014;March.

4. Wakayama T. “Prof. wants STAP findings withdrawn”. The Yomiuri Shimbun. 2014;11 March 2014.

5. Cyranoski, David (2014-01-29). “Acid bath offers easy path to stem cells”. Nature News (Nature Publishing Group).

6. Connor, Steve (2014-02-09). “Exclusive: The miracle cure – scientists turn human skin into stem cells”. independent.co.uk.

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