BIOTECNOLOGIA TRANSFORMADORA TOTALMENTE BRASILEIRA

BIOTECNOLOGIA TRANSFORMADORA TOTALMENTE BRASILEIRA

Edição Vol. 4, N. 9, 15 de Maio de 2017

DOI: http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2017.05.15.002

A utilização do peixe tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) como biofábrica para produção do hormônio de crescimento humano está entre as principais linhas de investigação de grupo de cientistas do Instituto de Ciências Biológicas (ICB). O trabalho, transdisciplinar, é parte de pesquisa mais ampla que recentemente gerou, a partir de uma única tese de doutorado, depósito de dez pedidos de patentes relacionadas à elaboração de estratégias inovadoras para modificação de células-tronco espermatogoniais e ao uso de nanomateriais para entrega de genes nesse tipo de célula.

Quatro das patentes depositadas abordam metodologias capazes de conduzirem à geração de tilápia fluorescente, que pode ser usada como modelo de estudo, biofábrica para produção de proteínas em larga escala ou como peixe ornamental. “Por suas características específicas, principalmente relacionadas à reprodução, o peixe oferece muita plasticidade para o trabalho com biologia celular e molecular. Mas enquanto há laboratórios no mundo inteiro que produzem camundongos transgênicos, ainda não há cultivo eficiente de modelo padronizado de peixe de experimentação”, informa a cientista Samyra Lacerda, integrante do grupo coordenado pelo professor Dr. Rodrigo Resende, do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em parceria com o professor Dr. Luiz Renato de França, atual Diretor do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia).

Ambos orientaram Fernanda Tonelli na tese que gerou os pedidos de patentes e que se beneficiou de estudos anteriores de Samyra, sob orientação do professor Luiz Renato de França (Departamento de Morfologia da UFMG e atual diretor do INPA) visando elucidação dos processos de isolamento e de cultivo da espermatogônia-tronco, que são células-tronco presentes nos testículos e base para o processo contínuo de produção de espermatozoides, em outros animais e em humanos. 

Transfecção

A busca pelo melhor meio de inserir um gene modificado na espermatogônia-tronco – processo conhecido como transfecção – levou a testes de uso de nanotubos de paredes múltiplas carboxilados, que ofereceram menor taxa de morte celular e maior índice de geração do transcrito da proteína fluorescente gerada após entrega do DNA plasmidial, que a codifica, com auxílio das nanoestruturas (Figura 1).

  

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Figura 1: Tilápia transgênica fluorescente gerada a partir do uso de nanomateriais. Diversas regiões do corpo da tilápia, durante o desenvolvimento, foram destacados mostrando a fluorescência. A nova tilápia produzirá uma ninhada inteira de peixes transgênicos, já que seus espermatozoides também o são geneticamente modificados. A proposta dos cientistas oferece oportunidade para produzir proteínas recombinantes para uso humano em larga escala e muito mais barata do que a atual.

“Surpreendidos pelo potencial desse nanoveículo, ampliamos o número de nanomateriais em teste e utilizamos ainda nanoóxido de grafeno, nanodiamantes, nanorods de ouro, todos sintetizados no Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia em parceria com o professor Luiz Orlando Ladeira do Departamento de Física e nanocompósitos de fosfato (oriundos de parceria com o professor José Dias do Departamento de Morfologia). Todos geraram depósito de pedido de patente relacionado a seu processo de síntese e funcionalização, além de uso para a entrega de ácidos nucleicos”, informa Rodrigo Resende, que coordena o Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia do ICB, mantido com recursos do Instituto Nanocell e do CNPq. 

Tais processos melhoraram a eficiência da transfecção, atualmente realizada majoritariamente com o reagente lipofectamina, que é muito citotóxico, ou seja, mata facilmente as células. A equipe realizou ainda ensaios com outras células de difícil transfecção – cardiomiócitos, células neuronais e tumorais do cérebro – e concluiu que também nelas os nanomateriais são eficientes (1-5). “Agora vamos produzir kits de transfecção com nanomateriais, que serão comercializados para pesquisadores e institutos de pesquisa através do Instituto Nanocell”, anuncia Resende. 

Outra linha de testes foi realizada com partículas lentivirais (vírus) como veículos de entrega. Ambos os tipos de transfecção são eficientes, mas se ajustam a diferentes finalidades: o primeiro oferece expressão do transgene apenas de maneira transiente, isto é, temporária, pois à medida que se dividem, as células que contêm a expressão podem morrer. Já as alterações realizadas por intermédio dos lentivírus tornam-se permanentes, pois passam a integrar o genoma. 

Biorreatores 

A obtenção da tilápia fluorescente foi apenas a porta de entrada para a padronização de técnicas que têm desdobramentos em múltiplas áreas. “O primeiro passo era descobrir se a espermatogônia-tronco aceitaria um DNA a ela entregue e como deveria ser feita esta entrega de maneira eficiente. Já que ela aceitou bem a construção e produziu a proteína fluorescente, o caminho está aberto para outros genes”, resume Fernanda Tonelli. Nesse caso, o uso da proteína fluorescente funcionou como “repórter”, ao mostrar aos pesquisadores que a célula fora efetivamente modificada. O peixe obtido no processo pode ser reproduzido como animal ornamental ou para estudos – com genes de crescimento da espécie, de resistência a antibióticos e a diferentes temperaturas, por exemplo (6). As variações geradas do peixe transgênico são fontes de outras 4 patentes. 

Os atuais trabalhos de Fernanda Tonelli concentram-se no uso de animais como biorreatores para a produção eficiente de hormônio de crescimento humano (hGH) e de outras proteínas de interesse para a saúde humana. “Em 2014 o Sistema Único de Saúde (SUS) gastou quase R$ 125 milhões com a importação de hGH”, informa a cientista, para demonstrar a importância dessa linha de investigação.

De acordo com Rodrigo Resende, a tecnologia desenvolvida por sua equipe “abre caminho para uma simples substituição de sequência de hGH no plasmídeo por outra de proteína de interesse econômico humano”. A intenção é gerar ampla gama de proteínas recombinantes passíveis de utilização em soros, vacinas e fármacos. Resende enfatiza que a bioquímica pode se beneficiar dessa proposta, “que vai ao encontro da Estratégia Nacional de Biotecnologia, na área prioritária agropecuária/aquicultura, ao utilizar plantas e animais como biorreatores para produção de biomoléculas”.


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Tecnologia brasileira

A mudança genética por meio da espermatogônia-tronco “é a vantagem da nossa metodologia, totalmente desenvolvida na UFMG, sobre a canadense utilizada para gerar o salmão transgênico aprovado pela FDA, que usa a técnica de microinjeção”, afirma Fernanda Tonelli. Segundo ela, na técnica desenvolvida no Canadá o gene de interesse é injetado durante a fertilização in vitro ou logo após esta, enquanto se tem uma única célula oriunda da fusão dos gametas. Como a integração genômica não é tão rápida quanto a divisão da célula-ovo na geração de um organismo, a sequência aparece em apenas algumas das novas células, gerando um “mosaico”. 

Como resultado, o peixe gerado vai expressar a proteína fluorescente em alguns lugares de seu organismo e, em, outros, não. “Aqui, modificamos a espermatogônia, que é transplantada de volta para o receptor, e conseguimos obter o gameta geneticamente modificado para fertilização de um ovócito. Assim, se obtém um transgênico total heterozigoto. Não se há a necessidade de passagem pela geração “mosaico”, consequência da microinjeção o que poupa tempo no estudo e aumenta a eficiência. Os trabalhos com microinjeção não têm essa eficácia: fazem três mil animais para obter algumas poucas unidades de transgênicos”, compara a cientista.

Os achados da tese de Fernanda Tonelli geraram 10  artigos científicos, três dos quais nos periódicos RSC Advances e Nanoscale, da Royal Society of Chemistry (Reino Unido – sendo um deles considerado destaque do mês de dezembro de 2015 pela Sociedade Brasileira de Pesquisa em Materiais), e um no periódico Scientifics Reports, do grupo Nature – este último, Gene delivery to Nile tilapia cells for transgenesis and the role of PI3K-c2? in angiogenesis, em março de 2017. Ainda há mais dois artigos em análise nos periódicos Nature Protocols e Biotechnology Advances. Também geraram dez capítulos de livros. “É uma das teses mais produtivas da UFMG”, afirma Rodrigo Resende.

A tecnologia produzida e os produtos patenteados conduziram à criação da Startup Nanocell. Esta foi recentemente selecionada, com este projeto, como estando entre os 21 melhores, em um grupo com mais de 351 empreendedores inscritos, vindos de 100 Instituições de 16 estados e 3 países diferentes. A equipe está participando do Biostarup Lab em rodada patrocinada pela Associação da Indústria Farmacêutica de Pesquisa – Interfarma.

Transplantes

Desenvolvida por Samyra Lacerda, a técnica de transplante de espermatogônia-tronco é outra linha de pesquisa que compõe as áreas de interesse do grupo coordenado por Rodrigo Resende e Luiz Renato França. O método consiste em transplantar a espermatogônia-tronco do testículo de um animal para o de outro, que passa a produzir espermatozoides do doador. Entre as várias aplicações possíveis está o autotransplante, para homens com câncer, que poderiam receber de volta o próprio material biológico colhido antes do tratamento quimioterápico, recuperando, assim, a fertilidade.

A técnica também pode beneficiar iniciativas de conservação de espécies ameaçadas de extinção. “Temos um trabalho com o pirarucu, peixe extremamente importante da Bacia Amazônica, que já desapareceu em alguns estados da Região Norte”, informa a cientista. Maior peixe de água doce no país, o pirarucu demora cinco anos para atingir a maturidade sexual e não se reproduz em cativeiro. 

“Transplantamos espermatogônia-tronco do pirarucu para o testículo da tilápia, peixe pequeno, barato, de fácil manutenção e do qual já se conhece todo o processo reprodutivo. Desse modo, a tilápia vai produzir o espermatozoide de pirarucu”, relata Samyra Lacerda. Ela explica que em peixes a espermatogônia-tronco tem uma particularidade: se transplantada para uma fêmea, ela se diferencia e gera ovócitos. “Assim, se transplantamos para indivíduos de ambos os sexos, conseguimos produzir espermatozoides e ovócitos a partir daquela célula-tronco. Em mamíferos ainda não temos relato desta plasticidade deste tipo celular”, completa. 

Fonte: Ana Rita de Araújo – Boletim UFMG 

Referências

1.Resende RR, Fonseca EA, Tonelli FM, Sousa BR, Santos AK, Gomes KN, et al. Scale/topography of substrates surface resembling extracellular matrix for tissue engineering. Journal of biomedical nanotechnology. 2014;10(7):1157-93.

2.TONELLI FMP, LACERDA SMSN, SILVA MA, AVILA ES, LADEIRA LO, FRANÇA LR, et al. Gene delivery to Nile tilapia spermatogonial stem cells using carboxi-functionalized multiwall carbon nanotubes. RSC Advances: an international journal to further the chemical sciences. 2014;4:37985-7.

3.Tonelli FMP, Santos AK, Gomes KN, Lorencon E, Guatimosim S, Ladeira LO, et al. Carbon nanotube interaction with extracellular matrix proteins producing scaffolds for tissue engineering. Int J Nanomed. 2012;7:4511-29.

4.Tonelli FM, Lacerda SM, Paiva NC, Pacheco FG, Scalzo Junior SR, de Macedo FH, et al. Functionalized nanomaterials: are they effective to perform gene delivery to difficult-to-transfect cells with no cytotoxicity? Nanoscale. 2015;7(43):18036-43.

5.Tonelli FM, Goulart VA, Gomes KN, Ladeira MS, Santos AK, Lorencon E, et al. Graphene-based nanomaterials: biological and medical applications and toxicity. Nanomedicine (Lond). 2015;10(15):2423-50.

6.Tonelli FM, Lacerda SM, Procopio MS, Lemos BL, de Franca LR, Resende RR. Gene delivery to Nile tilapia cells for transgenesis and the role of PI3K-c2alpha in angiogenesis. Scientific reports. 2017;7:44317.

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